Большинство современных технологий в фармакологии, биомедицине, материаловедении и многих других областях требуют исследования объектов на наноуровне. В настоящее время электронные микроскопы достигают пределов своих возможностей, и на смену им приходят сканирующие зондовые микроскопы или СЗМ. Участник кластера ядерных технологий Фонда «Сколково», ООО «НТ-МТД», занимающий второе место в мире на рынке СЗМ, успешно интегрирует атомно-силовой микроскоп с другими методами исследования, обеспечивая условия для изучения биологических объектов, близкие к условиям живого организма.
Людям всегда хотелось увидеть что-то недоступное глазу. Для этого они придумали оптические устройства – увеличительные стекла и микроскопы. Общий принцип их действия в том, что на интересующий нас объект падают лучи света, отражаются от него, проходят через увеличивающую линзу и попадают в глаз наблюдателя.
Казалось бы, создавая всё более сильные линзы, люди должны суметь увидеть всё более маленькие объекты: клетки в живых организмах, клеточные органы, крупные молекулы, отдельные атомы… Но, увы, уже примерно на уровне отдельных органов клетки оптическая микроскопия упирается в свой предел. Оказывается, что минимальный размер пятна, который можно получить, фокусируя излучение, ограничен из-за явления дифракции и равен половине длины волны этого излучения (так называемый дифракционный предел). Длина волны видимого света составляет от 380 до 740 нанометров, следовательно, объект размером, например, 200 нанометров мы разглядим уже с трудом.
На помощь пришли электронные микроскопы. На самом деле они не столь сильно отличаются от оптических, но в них на образец падает не поток фотонов, а поток электронов. Длина волны у электронов куда меньше, что позволяет исследовать более маленькие объекты. Пучок электронов фокусируется так называемыми магнитными линзами и направляется на образец. Часть электронов от него отражается, часть проходит сквозь него. Значит поток электронов «на выходе» несет информацию о структуре образца. Этот поток попадает на детекторы и благодаря этому можно построить изображение. Тут, кстати, следует отметить, что цвета, которые мы видим на образцах электронной микроскопии – результат обработки данных. В действительности микроскоп получает только информацию о потоке электронов. Итак, электронные микроскопы сильно расширили наши познания о мире, но и они, в конце концов, достигают предела своих возможностей.
Наконец, следующий шаг – сканирующие зондовые микроскопы. Надо сразу сказать, что в основу их действия положен совершенно иной принцип по сравнению с оптическими и электронными микроскопами. Никакой оптики, никаких волн. Объединяют их только слово «микроскоп» в названии и предназначение – исследование объектов сверхмалого масштаба. При этом сканирующие зондовые микроскопы позволяют нам увидеть даже отдельные атомы. Впрочем, правильнее будет сказать не «увидеть», а «нащупать». Этот глагол лучше описывает принцип работы зондового микроскопа.
«Сканирующие зондовые микроскопы бывают двух типов: сканирующие туннельные микроскопы (СТМ), использующие эффект туннельного тока между острием микроскопа и образцом (этот тип может быть использован только для проводящих образцов) и сканирующий атомно-силовой микроскоп (АСМ), который может применяться для любых образцов»,
- уточняет заместитель директора ООО «НТ-МДТ» Владимир Редченко.
АСМ использует силы, возникающие при взаимодействии между атомами (отсюда название типа зондовых микроскопов – атомно-силовые микроскопы, atomic-force microscope). Мы знаем со школы, что атомы и молекулы в целом электрически нейтральны. Ядро, несущее положительный заряд, окружают отрицательно заряженные электроны, в результате заряды нейтрализуют друг друга. Однако довольно давно ученые выяснили, что дело обстоит несколько сложнее. Так как электрический заряд не распределен в электронной оболочке атома или молекулы равномерно, возникает поляризация, когда у атома можно выделить положительный и отрицательный полюс. Еще более сильная поляризация может возникнуть под действием на атом внешнего электрического поля. Естественно, одинаково заряженные полюса разных атомов отталкиваются друг от друга, а заряженные по-разному – притягиваются. Эти силы притяжения и отталкивания получили название Ван-дер-Ваальсовых сил, в честь нидерландского физика, открывшего это явление еще во второй половине XIX века.
Конечно же, межатомные взаимодействия проявляются только на очень небольших расстояниях. Физики приложили немало усилий для изучения этих взаимодействий и смогли установить свойственные им закономерности. Когда две частицы находятся друг от друга на расстоянии, достаточном для возникновения этого взаимодействия, начинается воздействие электрического поля одной частицы на другую. Из-за отталкивания одноименных зарядов частицы поляризуются так, что окажутся обращены друг к другу разными электрическими полюсами. Поэтому между частицами возникает притяжение.
Межмолекулярные взаимодействияА что будет, если частицы сблизятся еще сильнее? В какой-то момент их электронные оболочки пересекутся и, как и положено одноименным электрическим зарядам, начнут отталкиваться. При этом, чем меньше расстояние между частицами, тем сильнее будет сила этого отталкивания.
Силу притяжения и отталкивания между частицами отражает график. По оси X в нем обозначено расстояние между молекулами. По оси Y – так называемая потенциальная энергия взаимодействия. Представьте, что вы удерживаете руками на очень скользком столе два магнита. Если они повернуты друг к другу одинаковыми полюсами, они будут отталкиваться, если разными – притягиваться. Та сила, которую вы должны приложить, чтобы магниты остались на месте – это и есть аналог потенциальной энергии взаимодействия между частицами. На малых расстояниях эта энергия положительна – частицы отталкиваются, когда расстояние увеличивается, наступает момент, когда они начинают притягиваться (там, где график ныряет под ось Х). Но если расстояние становится всё больше и больше, то сила притяжения постепенно убывает.
Вот и весь теоретический фундамент атомно-силовых микроскопов. Придумали, как использовать эти явления, Герд Бинниг (Gerd Karl Binnig), Кельвин Куайт (Calvin Quate) и Кристоф Гербер (Christoph Gerber) в 1986 году. В созданном ими микроскопе зонд (игла) перемещается над исследуемой поверхностью. На сверхмалых расстояниях между зондом и атомами исследуемого объекта возникают силы притяжения или отталкивания, природу которых мы обсудили.
Устройство, на котором закреплен зонд, называется кантилевер (cantilever). Его можно сравнить с доской, на которой стоит прыгун в воду. Только, конечно же, кантилевер значительно меньше. Доска на прыжковом трамплине, закрепленная с одного конца, может прогибаться (это использует прыгун, чтобы получить дополнительную энергию для прыжка). Кантилевер изгибается под влиянием сил, действующих на зонд. Если измерить степень изгиба кантилевера, можно определить силу взаимодействия зонда с поверхностью, а значит и рельеф поверхности. Для регистрации этого изгиба есть разные методы. Например, используют лазерный луч, отражающийся от кантилевера и направленный на фотоэлемент. Когда кантилевер изгибается, точка попадания луча на фотоэлемент смещается, и это смещение можно отследить. Затем при помощи компьютерной обработки полученных данных строится модель поверхности, над которой проходил зонд.
Получается, что атомно-силовой микроскоп не занимается фиксацией какого-либо излучения, отраженного от образца. Его зонд как бы ощупывает образец, подобно тому, как слепой человек своей тростью ощупывает неровности почвы. Только в данном случае «трость» обнаруживает неровности величиной в доли нанометра. Другой аналог – это игла звукоснимателя, использовавшаяся еще не так давно для воспроизведения музыки с виниловых пластинок. Но и в этом случае неровности звуковой дорожки, которые «чувствует» игла, значительно крупнее тех, для которых предназначен зондовый микроскоп.
Устройство атомно-силового микроскопаВажнейшие части атомно-силового микроскопа – кантилевер и зонд. Кантилевер делается из кремния или же оксида или нитрида кремния. Его толщина составляет от 0,1 до 5 мкм, ширина – от 10 до 40 мкм, а длина – от 100 до 200 мкм. Расстояние между зондом и поверхностью исследуемого образца в зондовых микроскопах составляет обычно от 0,1 до 10 нм. Чтобы улучшить отражательные свойства кантилевера, на его верхнюю поверхность, куда будет направлен лазерный луч, наносят тонкий слой золота или алюминия. Для высокоточных перемещений кантилевера и зонда используются шаговые электродвигатели.
Чтобы такой микроскоп работал без искажений, его необходимо оберегать от внешних воздействий. Особую заботу конструкторов составляет защита от вибраций (причем источником значительной вибрации в данном случае может быть даже обычные звуковые волны). Другой вид помех – деформации частей микроскопа из-за повышения температуры во время его работы.
Рельеф поверхности стекла, полученный атомно-силовым микроскопомСоздателям атомно-силовых микроскопов приходится решать много проблем, но основная их забота, главное действующее лицо микроскопа – зонд. Это игла с радиусом закругления всего несколько нанометров. Делаются зонты из кристалла кремния или же нитрида кремния. Иногда на зонд наносят сверхтонкие покрытия из золота, платины, хрома, вольфрама, молибдена, титана и других материалов.
Увы, зонды представляют собой расходный материал. Их свойства ухудшаются в процессе работы, поэтому зонд необходимо регулярно заменять. Также крайне важно качество этого ключевого элемента атомно-силового микроскопа, ведь от него зависит точность получаемых изображений.
Среди участников кластера ядерных технологий Фонда «Сколково» разработками в области атомно-силовой микроскопии заняты две компании: НТ-МДТ и «ТопСкан».
Группа компаний НТ-МДТ работает в этой области уже давно. Первая из группы этих компаний - ЗАО «НТ-МДТ» - была создана в 1990 году в Зеленограде. За время своего существования Группа компаний поставила отечественным и зарубежным заказчикам более 4000 приборов. Сейчас это лидер отрасли в России (и занимает второе место в мире на рынке сканирующих зондовых микроскопов). Среди особенно интересных разработок НТ-МДТ есть системы, где атомно-силовой микроскоп интегрирован с другими методами исследования. Например, в системе «ИНТЕГРА Спектра» объединены атомно-силовой микроскоп, оптический конфокальный микроскоп и устройство для Рамановской спектроскопии (Рамановский спектрометр = спектрометр комбинационного рассеивания).
Новая модель для биоисследований, прибор «LIFE» объединяет зондовый микроскоп с оптическим дальнепольным микроскопом, это устройство предназначено для исследования объектов молекулярной и клеточной биологии в условиях, близких к условиям живого организма. Среди созданных НТ-МДТ микроскопов есть и НАНОЭДЮКАТОР – атомно-силовой микроскоп, предназначенный для обучения лабораторных работников.
«В нашей заявке в Сколково представлены четыре направления: создание зондового микроскопа для считывания результатов с биочипов, разработка приборов для нанолокальных измерений ИК-спектров, что также делается с помощью зондовой микроскопии, разработка программно-аппаратного обеспечения скоростных методов сканирующей зондовой микроскопии и разработка скоростных широкоформатных измерительных головок для атомной силовой микроскопии.
Все эти разработки будут вестись в рамках фирмы ООО «НТ-МДТ», организованной для участия в проекте Сколково. Команды сформированы, они работают. Если мы получим какие-то гранты в Сколково (сейчас мы готовим заявки на гранты и соглашение о партнерстве), переедем туда, то мы там и развернемся», - рассказал Владимир Редченко.
Кантилевер и зонд атомно-силового микроскопаВице-президент, Исполнительный директор Кластера ядерных технологий Фонда «Сколково» Игорь Караваев прокомментировал сотрудничество с НТ-МДТ и поделился перспективными разработками в области микроскопии:
«Помимо того, что НТ-МДТ представлена в Кластере двумя проектными компаниями, развивающими различные направления применения компетенций по микроскопии, компания также рассматривает и другие варианты партнерства со «Сколково», вплоть до формирования отдельного R&D филиала на территории Инновационного центра.
Тематика аналитического оборудования и, в частности, оборудования для микроскопии представлена в Кластере ядерных технологий «Сколково» и другими проектами. Например, компания «СНОТРА» разработала криотомограф для изучения замороженного биологического материала, в основе которого опять же сканирующий зондовый микроскоп. А компания «Медицинские нанотехнологии» разработала и предлагает к использованию другой тип микроскопа - сканирующий ион-проводящий и конфокальный. Этот микроскоп является идеальным инструментом исследователя, работающего с нейронами головного мозга и позволяет изучать реакции нейронов на новые лекарства».
«ТопСкан» – компания более молодая. Она была создана на базе Института кристаллографии РАН, ее деятельность сосредоточена на разработке ключевого элемента атомно-силовых микроскопов – зондов. Год назад проект компании «ТопСкан» – «Зонды нового поколения» – получил одобрение Грантового комитета Фонда «Сколково».
Перспективы развития атомно-силовой микроскопии велики. Она позволяет исследовать материалы на наноуровне, что необходимо для многих современных технологий. Зонд атомно-силового микроскопа может «ощупать» молекулы важных биологических веществ: ДНК, аминокислот, белков и так далее – это окажется полезным для современной фармакологии и других биомедицинских разработок. Изучение процессов коррозии, исследование вирусов, создание полупроводниковых устройств, микросхем – для всего этого может послужить атомно-силовой микроскоп.